端粒重复因子2与p53的体外结合
摘要
目的通过分析端粒主要结合蛋白端粒重复因子2 (TRF2)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法 4种不同的p53-谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白和GST经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化,其中的人重组p53包括野生型(1～393)、C端缺失体p53 N5(2～293)、N端缺失体p53 N5(95～393)、第175位氨基酸突变体(R→H).将各纯化蛋白和人乳腺癌细胞MCF-7的细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot 检测反应物中p53和TRF2的结合.结果纯化的GST和p53-GST融合蛋白纯度均在90%以上,且相对分子质量与预计的完全一致.TRF2的Western blot显示:野生型p53和p53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRF2,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRF2的作用.与野生型p53和p53 R175H相比,p53 2C与TRF2的结合力相对增加,p53 N5与TRF2的结合力相对大大减弱.结论 p53和TRF2可以进行直接而特异的体外结合,且其结合部位在p53 的C端(293～393). p53和TRF2 的C端依赖性结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.
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