表皮生长因子受体（EGFR）通路下游基因的激活突变可以引起结直肠癌患者抗EGFR耐药。本文介绍用来检测这些突变的新一代测序分析性能特点。本回顾性质量评估研究中，我们用通过临床验证的新一代测序分析检测310例结直肠癌标本中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的突变情况。通过分析肿瘤细胞的密度及等位基因突变的几率来确定肿瘤异质性和等位基因特异性突变的不平衡性。新一代测序技术对等位基因特异性突变几率非常精确，检测出了23%的基因突变、其中等位基因突变的几率达2-20%。KRAS的基因突变中，我们检测到17%是位于12号和13号密码子以外的。PIK3CA的基因突变中，48%是位于542号、545号和1047号密码子以外的。仅检测KRAS基因2号外显子基因突变时，预测抗EGFR治疗耐药肿瘤的比例为40%，检测2-4号外显子时该比例增加至47%，而检测KRAS和NRAS的2-4号外显子时，增加至48%；加入BRAF 600号密码子突变时为58%；加入PIK3CA的20号外显子突变时为59%。右半结肠癌预测抗EGFR治疗耐药的风险更高。已发现在KRAS突变可见于51%的PIK3CA、23%的NRAS及33%的激酶受损BRAF突变的肿瘤中。等位基因突变几率预测肿瘤异质性方面低于预期，但等位基因突变几率预测等位基因特异性突变不平衡性方面则高于预期。神经内分泌癌及相邻的腺瘤配对研究，表明具有相同的KRAS突变，但神经内分泌癌中仅见PIK3CA突变。下一代测序技术将成为临床检测突变的一个强大工具。它具有较高的分析灵敏度及更广泛的报告内容，并且它可同步检测伴随突变，并对等位基因突变几率预测肿瘤异质性和等位基因特异性突变不平衡性进行定量检测。